Genomics and formulation optimization for enhancing the microbial safety of dry fermented sausages

Abstract

ENG- Dry fermented sausages (DFS) are traditional meat products with high production and consumption in Mediterranean countries. Microbial communities of DFS vary throughout the production process, providing characteristic organoleptic traits. Acidification and drying are two of the main processes contributing to the shelf-stability and food safety of DFS, while other antimicrobials (e.g., bacteriocins) can contribute to the safety. Currently, genomic technologies are changing the paradigm in food microbiology, covering the identification of microbial communities within a complex food or surface sample with culture-independent techniques and the genomic characterization of pathogenic isolates recovered from a contaminated sample. The aim of the thesis was to study the microbial communities of DFS, with innovative formulation and production processes, and to develop strategies to control Salmonella and Listeria monocytogenes as the main pathogens in this type of meat products.

The microbiota of DFS elaborated (i) without nitrifying salts and adding a pork liver auto-hydrolysate innovative ingredient, rich in zinc protoporphyrin as a colour-enhancement agent and, (ii) with a sodium reduction by replacing NaCl by KCl was investigated. The bacterial communities were followed by the 16S rRNA gene metataxonomic approach. DFS formulated with no added nitrifying salts and submitted to low temperatures allowed the growth of spoilage-related bacteria and showed high bacterial diversity. In contrast, less bacterial diversity was shown in nitrified DFS formulated with the Latilactobacillus sakei CTC494 starter culture, that led the fermentation process and was the dominant species.

The second study aim was to genomically characterize Salmonella isolates and search for phylogenomic relationships between industrial isolates, nationally and internationally. Within the ten different Salmonella serovars encountered in the genomic panel (N=173 Salmonella genomes), S. 1,4,[5],12:i:- was the most prevalent serovar in DFS while S. Derby was in pig carcasses. Phylogenetic clusters were found within genomes with few allelic and single nucleotide polymorphisms differences in the core genome. Antimicrobial and biocide resistance genes, virulence genes and mobile genetic elements were found distinctly between the Salmonella serovars, highlighting the multidrug resistance gene profile in 91% of the S. 1,4,[5],12:i:- genomes and the extended-spectrum β-lactamase genes detection in Typhimurium and Derby serovars. The multidrug resistance genes identification and persistence of Salmonella, especially S. 1,4,[5],12:i:-, in DFS production chain is of importance by food safety managers and DFS producers, respectively.

The third study aimed to optimise the antilisteria potential of L. sakei strains in DFS production. The behaviour of the sakacin K producer L. sakei CTC494 and the non-bacteriocinogenic L. sakei 23K was studied when cultured with and without L. monocytogenes in meat simulation media. Different formulations of NaCl, manganese, glucose and temperature were applied in a central composite design. Glucose was the most influencing factor for, lactic acid production and pH decrease, and moderate temperatures for sakacin K production. Only when L. sakei strains entered the early stationary phase, L. monocytogenes growth was inhibited by the 23K strain, while the pathogen was inactivated in coculture with the bioprotective CTC494 strain. Five log reduction of L. monocytogenes was achieved at 20 °C, 20 g/L NaCl, 0.20 g/L Mn and 40 g/L glucose

CAT- Els embotits crus curats (ECC) són productes carnis tradicionals amb una elevada producció i consum en els països mediterranis. Les comunitats microbianes dels ECC varien al llarg del procés de producció, proporcionant trets organolèptics característics. L'acidificació i l'assecat determinen l’autoestabilitat i seguretat alimentària dels ECC mentre que altres antimicrobians contribueixen en la seguretat. Actualment, les tecnologies genòmiques estan canviant el paradigma de la microbiologia des de la identificació de les comunitats microbianes amb tècniques independents de cultiu fins a la caracterització genòmica de microorganismes aïllats d’una mostra contaminada. L'objectiu de la tesi va ser estudiar les comunitats microbianes dels ECC, amb processos innovadors de formulació i producció, i desenvolupar estratègies per controlar Salmonella i Listeria monocytogenes com a principals patògens relacionats amb aquest tipus de productes carnis.

Es va estudiar la microbiota dels ECC elaborats (i) sense salts nitrificants i addicionant un ingredient innovador basat en un autohidrolitzat de fetge de porc, ric en protoporfirina de zinc com a agent que millora el color, i (ii) amb una reducció de de sodi, substituint NaCl per KCl. El seguiment de les comunitats bacterianes es va fer a través de l'enfocament metataxonòmic, seqüenciant el gen 16S rRNA. Els ECC formulats sense sals nitrificants i sotmesos a baixes temperatures va permetre el creixement de créixer bacteris alteradors i van demostrar una alta diversitat bacteriana. Per altra banda, es va observar poca diversitat bacteriana en els ECC formulats amb agents nitrificants i el cultiu iniciador Latilactobacillus sakei CTC494, el qual va liderar el procés de fermentació i va ser identificada com a espècie dominant.

L’objectiu del segon l'estudi va ser caracteritzar genòmicament aïllats de Salmonella d’ambients industrials de producció i buscar relacions filogenòmiques, a nivell nacional i internacional. D’entre els deu serovars trobats al panell genòmic d’estudi (N=173 genomes), S. 1,4,[5],12:i:- va ser el serovar més freqüent en ECC, mentre que S. Derby va ser el més freqüent en canals de porc. Es van identificar agrupacions filogenòmiques entre genomes amb poques diferències al·lèliques i mutacions puntuals en la seqüència nucleotídica del genoma central i més conservat dins l’espècie. Els gens de resistència a antimicrobians i biocides, gens de virulència i els elements genètics mòbils, es van trobar en miscel·lània entre els serovars de Salmonella, destacant el perfil genètic de resistència a múltiples antimicrobians en el 91% dels genomes de S. 1,4,[5],12:i:-, mentre que els gens de resistència a β-lactamases d'espectre estès es van trobar als serovars de Typhimurium i Derby. La identificació de gens de resistència a múltiples antimicrobians i la persistència de Salmonella, especialment S. 1,4,[5],12:i:-, a la cadena de producció de DFS és d'importància per als gestors de seguretat alimentària i els productors de DFS, respectivament.

L’objectiu del tercer estudi va ser la optimització del potencial antilisteria de L. sakei. El comportament de les soques L. sakei CTC494 (productora de sakacina K) i 23K (lno bacteriocinogènica) es va estudiar cultivades amb i sense L. monocytogenes en un medi de simulació de carn. Es va aplicar un disseny central compost combinant diferents condicions de NaCl , manganès, glucosa , i temperatura. La glucosa va ser el factor més influent de la producció d'àcid làctic i la disminució del pH, i les temperatures moderades en la producció de sakacina K. Només quan L. sakei va començar a entrar en fase estacionària, L. monocytogenes es va inhibir en el cocultiu amb la soca 23K i es va inactivar en el cocultiu amb la soca CTC494. Es va aconseguir una reducció de 5 unitats logarítmiques de L. monocytogenes a 20 °C, 20 g/L de NaCl, 0,20 g/L de Mn i 40 g/L de glucosa