Computational exploration and design of HHDH variants with novel synthetically useful functionalities

Abstract

Enzymes are the best catalysts. They are the main catalysts in

cells and have been exposed to millions of years of natural evolution

by including random mutations in their sequence and posterior

selection. Some enzymes show extreme catalytic rates, selectivity,

or stability, but not all are suitable for industrial or pharmaceutical

applications. Their use in industrial contents would be very advantageous,

thanks to the fact that enzymes are naturally biodegradable

molecules, work in water-based solvents, and are non-toxic. These

properties are critical for a suitable future for the new generations.

It is crucial to design enzymes for catalyzing industrially relevant

reactions.

One enzyme family with significant usage in the pharmaceutical

industry is Halohydrin Dehalogenasses (HHDH). These enzymes

convert (S)-4-chloro-3-hydroxybutyrate into ethyl (R)-4-cyano-

3-hydroxybutyrate, a precursor of statin drugs that need to be

enantiomerically pure. Not all HHDHs can perform this catalysis

due to their inability to accept the substrate (they have a limited

substrate scope), and insufficient enantioselectivity, stability, or

activity. The design of new enzymes that display good properties in

the selected industrial environment is nowadays possible, thanks to

the experimental Directed Evolution technique. Still, this protocol

mutates residues randomly. The effect of the mutations is not

rationalized and usually requires the production and screening of

multiple (thousands) variants, which has a high cost associated.

Computational protocols, based, for instance, on Molecular Dynamics

(MD) simulations, allow for rationalizing the effect of the

introduced mutations onto the ensemble of conformations that the

enzymes can explore. Still, analyzing MD simulation outputs can be

challenging, and there is no gold standard that gives good results

and is computationally feasible. From these MD simulations, the

identification of which amino acid positions need to be changed to

enhance a given property is also not straightforward.

In this thesis, a novel pipeline for analyzing the variance obtained

during the MD simulations and the accessible tunnels has

been developed and is described in Chapter 4. This new protocol

was applied to explore the tunnels in all HHDH families, compare

the results with the reported features of each HHDH, and propose

new mutagenesis sites (Chapter 5). Chapter 6 describes the

newly discovered D-family HHDHs and some proposed variants

from Prof. Anett Schallmey’s group, and the thermal stability mechanism

is unveiled. Finally, in Chapter 7, the most evolved variant

generated via Directed Evolution, i.e., HheC R18, is experimentally

and computationally characterized to rationalize the effect of

the randomly introduced mutations and how these affect the stability,

oligomerization, cooperativity, and catalytic parameters of the

HHDH enzyme.

Els enzims són els millors catalitzadors que hi ha. Són els principals

catalitzadors a les cèl·lules i han estat exposats a milions d’anys

d’evolució natural, incloent-hi mutacions aleatòries en la seqüència

i posterior selecció. Alguns enzims mostren velocitats catalítiques,

selectivitat o estabilitat molt elevades, però no tots són adequats per

a aplicacions industrials o farmacèutiques. El seu ús industrial seria

molt avantatjós, gràcies al fet que els enzims són molècules naturalment

biodegradables, funcionen en dissolvents de base aquosa i no

són tòxiques. Aquestes propietats són crítiques per a un futur adequat

per a les noves generacions. És crucial dissenyar enzims per

catalitzar reaccions industrialment rellevants.

Una família d’enzims amb un ús significatiu a la indústria farmacèutica

són les Deshalogenases d’Halohidrines (HHDH). Aquests

enzims converteixen el (S)-4-clor-3-hidroxibutirat a (R)-4-cià-3-

hidroxibutirat d’etil, un precursor de les estatines que han de ser

enantiomèricament pur. No totes lesHHDHpoden realitzar aquesta

catàlisi a causa de la seva incapacitat per acceptar el substrat (tenen

un ventall de substrats limitat), enantioselectivitat, estabilitat o activitat

insuficients. El disseny de nous enzims que mostrin bones

propietats a l’entorn industrial seleccionat és avui en dia possible

gràcies a la tècnica experimental d’Evolució Dirigida. Tot i això,

aquest protocol muta residus aleatòriament. L’efecte de les mutacions

no està racionalitzat i normalment requereix la producció i selecció

de múltiples (milers) variants, cosa que té un alt cost associat.

Els protocols computacionals, basats, per exemple, en simulacions

de Dinàmica Molecular (MD), permeten racionalitzar l’efecte

de les mutacions introduïdes al conjunt de conformacions que els

enzims poden explorar. Així i tot, analitzar els resultats de la simulació

de MD pot ser un desafiament, i no hi ha un estàndard que

sempre brindi bons resultats i sigui computacionalment factible. A

partir d’aquestes simulacions de MD, la identificació de les posicions

d’aminoàcids que s’han de canviar per millorar una propietat determinada

no és senzill.

En aquesta tesi, s’ha desenvolupat un protocol nou per analitzar

la variància obtinguda durant les simulacions MD i els túnels

accessibles i es descriu al Capítol 4. Aquest nou protocol es va

aplicar per explorar els túnels a totes les famílies HHDH, comparar

els resultats amb les característiques reportades de cada HHDH,

i proposar nous llocs de mutagènesi (Capítol 5). El Capítol 6

descriu els HHDH de la família D acabats de descobrir i algunes

variants proposades pel grup de la Prof. Anett Schallmey, i es

revela el mecanisme d’estabilitat tèrmica. Finalment, al Capítol 7, la

variant més evolucionada generada a través de l’Evolució Dirigida,

és a dir, HheC R18, es caracteritza experimentalment i computacionalment

per racionalitzar l’efecte de les mutacions introduïdes

aleatòriament i com aquestes afecten l’estabilitat, l’oligomerització,

la cooperativitat i paràmetres catalítics de l’enzim HHDH.